振荡法评价金属材料抗菌性能研究初探

时间:2018-12-20 00:27:46 来源:CIAA 点击量:

王友斌 潘力军 薛金荣 王俊起
(中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所)
 
[摘 要]  目的:研究振荡法评价金属材料抗菌性能的可行性。方法:以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为评价菌种,采用振荡法对8种金属材料的抗菌性能进行评价,采用原子吸收法分析溶液中的铜离子浓度。结果:紫铜、氧化处理亲水紫铜箔、黄铜和白铜四种铜材料对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌活性均在99%以上,其他四种材料均没有表现出抗菌活性。结论:振荡法可以用来评价金属材料的抗菌性能。
[关键词]  振荡法;金属材料;抗菌
 
Study of Antibacterial Performance of Metal Materials with Oscillation Culture Method
WANG You-bin, PAN Li-jun, XUE Jin-rong, WANG Jun-qi
 (National Institute of Environment Health and Related Product Safety, Chinese Center for Disease Prevention and Control, Beijing, 100050)
Abstract  [Objective]  To explore the feasibility of antibacterial performance assessment of metal materials by oscillation culture method. [Methods]  The antibacterial performance of several metal materials were assessed by oscillation culture method and the concentration of Cu(II) ion in the oscillation solution was analyzed by flame absorption spectrophotometric method. [Result]  The antibacterial performance of red copper, oxidized hydrophilic copper, H65 brass and B10 cupronickel for Escherichia coli 8099 and Staphylococcus aureus ATCC 6538 were all over 99%, the others had no antibacterial activity. [Conclusions] The oscillation culture method could be used to assess the antibacterial performance of metal materials. 
Key Words  Oscillation culture method  Metal material  Antibacterial
  
金属及其复合材料具有良好的抗菌性能,已被广泛应用于各种抗菌领域。负载多层银铜膜的导尿管表面具有良好的抗菌活性,与浓度为2.68×106 cfu/ mL 的金黄色葡萄球菌液接触10 h,菌液中菌落数大幅度减少;接触24 h,金黄色葡萄球菌全部被灭活[1]。但是目前我国缺乏对金属材料抗菌性能评价的卫生检测方法和标准,不利于产品的规范管理和使用,因此建立快速、简便、可靠、易行的金属材料抗菌性能评价方法十分重要。振荡法是一种评价抗菌织物抗菌性能的检测方法,具有检测结果准确可靠等优点。本文以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为测试菌种,采用振荡法评价几种金属材料的抗菌性能,探讨振荡法评价金属材料抗菌性能的可行性。
  
1材料和方法
1.1材料
1.1.1 试验样品
紫铜、氧化处理亲水紫铜箔、H65黄铜、B10白铜、不锈钢304、不锈钢316L、抗菌塑料和空调用亲水铝箔8种材料。
三种铜合金的成分构成如下:
紫铜:Cu99.9%,S<0.005%,Sn<0.002%,Pb<0.005%,Fe<0.005%,Ni<0.005%, Sb<0.002%,Bi<0.001%,As<0.002%,Zn<0.005%,O<0.06%;H65黄铜:Cu65%,Zn<34.6%,Fe<0.1%,Pb<0.03%,Sb<0.005%,Bi<0.002%,P<0.01%;B10白铜:Cu90%,Ni<9%,Fe<1%,Mn微量。
1.1.2 对照样品
3mm厚石英玻璃片。
1.1.3 菌种
金黄色葡萄球菌(ATCC6538)和大肠杆菌(8099)购自中国药品生物制品研究所。
将37℃培养24h的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌斜面分别挑取适量于无菌0.03 mol/L的PBS 溶液中,混合、逐步稀释至菌悬液浓度为106-107cfu/mL待用。
1.1.4 试验器材
震荡混旋器,生物安全柜,电热恒温培养箱,1mL、5mL灭菌吸管,灭菌试管,接种环,压力蒸汽灭菌器,直径为90mm的灭菌平皿和250mL灭菌三角烧瓶。
1.2 方法
1.2.1样品预处理
(1)将试验样品切割成10 mm×10 mm的方形样片。试验样品先用75%乙醇溶液浸泡,再用无菌蒸馏水反复冲洗,无菌蒸馏水浸泡过夜,56℃烘干。
(2)空白对照样品用75%酒精浸泡20分钟后,用无菌蒸馏水冲洗干净,56℃烘干。然后将试验样品和空白对照样品置于已灭菌的250 mL三角烧瓶中。
1.2.2试验步骤
(1)将0.75 g试验样片放入250 mL三角烧瓶中,分别加入70 mL PBS和5 mL菌悬液,使试验菌在PBS溶液中的浓度为104~105 cfu /mL。
(2)将三角烧瓶固定于振荡摇床上,在温度20~25℃的条件下,300 r/min振荡2 min。吸取1.0 mL作为振荡前样液,用PBS溶液适当稀释后以琼脂倾注法接种平皿,每个样液接种两个平皿,培养后计数菌数。振荡在达到设定作用时间时,吸取样液1.0 mL,用PBS溶液适当稀释后以琼脂倾注法接种平皿,每个样液接种两个平皿,培养后计数菌数。同时吸取样液1.0 mL,采用原子吸收法测定溶液中的铜离子浓度[4]
试验同时设对照样片组和不加样片组。对照样片组以不含抗菌材质、大小相同的对照样片代替抗菌样片,本试验采用3mm厚石英玻璃片为对照样片,其他操作程序与试验组相同。不加样片组分别取5 mL菌悬液和70 mL PBS溶液加入250 mL三角烧瓶中,其他操作程序与试验组相同。
1.3数据分析及效果评价

式中:
R:抑菌率,单位为(%):
A:样品振荡前平均菌落数,单位为(cfu/mL);
B:样品振荡后平均菌落数,单位为(cfu/mL)。
 
2 结果
2.1不同菌种对金属材料抗菌性能评价结果的影响
(1)金黄色葡萄球菌
表1  金黄色葡萄球菌对金属材料抗菌性能评价结果的影响     单位:(cfu/mL)
材料 暴露时间
0h 2h 4h 8h 24h
紫铜 5.04×104 1.35×104 9.8×103 161 26
氧化处理亲水紫铜箔 5.04×104 1.30×104 1.13×104 21 5
H65黄铜 5.04×104 1.42×104 1.02×104 10 1
白铜 1.19×104 8.0×103 5.0×103 13 1
不锈钢304 5.04×104 1.81×104 1.87×104 1.76×104 2.69×104
空调用亲水铝箔 5.04×104 1.86×104 1.83×104 1.59×104 2.42×104
不锈钢316L 1.19×104 1.18×104 1.38×104 1.13×104 1.29×104
塑料 1.19×104 1.17×104 1.04×104 1.06×104 1.24×104
表1为不同金属材料在不同振荡暴露时间对金黄色葡萄球菌的抗菌试验结果。在振荡时间为2h时,紫铜、氧化处理亲水紫铜箔和黄铜振荡溶液中的菌落数分别减少73.21%、74.21%和71.82%;白铜振荡液中菌落数仅降低32.77%;不锈钢304和空调用亲水铝箔振荡液中菌落数分别降低64.09%和63.10%;不锈钢316L和塑料振荡液中的菌落数没有变化。当时间增加到8h时,紫铜、氧化处理亲水紫铜箔、黄铜和白铜均显示出明显的抗菌活性,分别为99.68%、99.95%、99.98%和99.89%;不锈钢304、空调用亲水铝箔、不锈钢316L和塑料与2h的结果无差别。当时间提高到24h,紫铜、氧化处理亲水紫铜箔、黄铜和白铜四种铜材料的抗菌活性均达99.94%以上;其他四种材料则均未表现出抗菌活性。
(2)大肠杆菌          
表2  大肠杆菌对金属材料抗菌性能评价结果的影响     单位:(cfu/mL)
材料 暴露时间
0h 2h 4h 8h 24h
紫铜 2.64×104 1.02×104 1.02×103 2.10×102 6
氧化处理亲水紫铜箔 2.64×104 1.24×104 1.36×103 1.59×102 11
H65黄铜 2.64×104 8.64×103 6.67×103 1.39×102 9
白铜 1.61×104 1.38×104 1.34×104 1.49×104 10
不锈钢304 2.64×104 1.98×104 2.38×104 1.02×104 1.38×105
空调用亲水铝箔 2.64×104 1.86×104 1.23×104 9.9×103 7.50×103
不锈钢316L 1.61×104 1.49×104 1.33×104 1.42×104 2.08×104
塑料 1.61×104 1.54×104 1.29×104 1.44×104 2.11×104
表2为不同金属材料在不同振荡暴露时间对大肠杆菌的抗菌试验结果。在振荡2h时,上述8种材料振荡溶液中的菌落数均无明显变化。振荡时间增加到8h时,紫铜、氧化处理亲水紫铜箔和黄铜已经表现出明显抗菌活性,抗菌活性均在99.2%以上;白铜、不锈钢304、不锈钢316L和塑料没有表现出明显抗菌活性,空调用亲水铝箔振荡液中的菌落数降低63.5%。当振荡暴露时间提高到24h,紫铜、氧化处理亲水紫铜箔、黄铜和白铜四种铜材的抗菌活性均在99.93%以上;不锈钢304、不锈钢316L和塑料则均未表现出抗菌活性,空调用亲水铝箔的菌落数降低幅度与8h时无明显差异。
2.3 振荡时间对金属材料抗菌性能评价结果的影响
表3          不同振荡时间铜离子的溶出状况              单位:(mg/L)
材料种类 2h 4h 8h 12h 16h 24h
紫铜 0.40 2.28 1.68 1.49 1.42 1.21
氧化处理亲水紫铜 0.5 1.06 2.78 2.29 1.48 0.98
黄铜 0.72 1.10 1.54 1.40 1.31 1.46
白铜 0.35 0. 75 1.47 1.23 1.14 1.04
8种金属材料中紫铜、氧化处理亲水紫铜箔、黄铜和白铜均表现出抗菌活性。紫铜、氧化处理亲水紫铜箔、黄铜和白铜四种铜材料分别是99%以上的纯铜、经过表面钝化处理的纯铜、铜锌合金以及铜镍合金。从抗菌试验评价结果可知,尽管都是含铜材料,但是在不同振荡暴露时间表现出的抗菌活性不相同。因此分析四种铜材料振荡溶液中的铜离子浓度,试验结果见表3。
从表3数据可见,紫铜溶液中铜离子浓度最高点在4h,为2.28mg/L,氧化处理亲水紫铜、黄铜和白铜的铜离子浓度最高点均在8h,分别为2.78 mg/L、1.54 mg/L和1.47 mg/L。四种铜材料振荡溶液中铜离子浓度均随时间先增加后逐渐降低,最后趋于稳定。
 
3 讨论
金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌性能评价结果表明,在不同菌种抗菌性能评价试验,4种铜材均表现出抗菌活性,而其他4种均没有抗菌活性,没有出现假阳性的研究结果。这表明振荡法可以用于评价金属材料的抗菌性能。但是采用振荡法评价金属材料抗菌性能时,每种评价材料的振荡时间必需一致,本研究表明振荡时间至少为24 h。
振荡溶液中铜离子浓度先升高后降低的原因可能是由于溶出的铜离子与菌体发生作用,改变了铜离子的性态,降低溶液中Cu(II)离子浓度;随着溶液中菌落数的不断减少,铜离子浓度受微生物的影响越来越小,而受到铜表面与溶液中铜离子的作用影响越来越大,当二者达到平衡时,铜离子浓度趋于稳定。铜离子浓度峰值出现的时间不同可能是导致不同的铜材料在同一时间显示出不同抗菌活性的原因。
 
参考文献
1 Hussain AA, Sayer M, Vincent PJ, Hughes DJ, Smith TJ. Antibacterial activity of multilayer silver-copper surface films on catheter material. Can-J-Microbiol. 1993,39(9):895-899
2 隆泉,郑保忠,孔辉.抗菌织物的抗菌性快速检测方法研究:奎因法的改良.上海纺织科技.2007,35(4):122-124
3童忠良.无机抗菌新材料与技术.北京:化学工业出版社,2006:12-23
4中华人民共和国卫生部. GB/T 5750.6-2006生活饮用水标准检验方法 金属指标

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