华东理工大学刘润辉团队开发出高效抗真菌聚合物
时间：2022-02-25 14:52:51 来源：高分子科学前沿 点击量：
侵袭性真菌感染主要由念珠菌属、隐球菌属和曲霉属等致病菌引起，发病率和死亡率高，尤其是一些免疫能力低下的群体，该病的感染人数正在不断增加，给人类健康带来了严重威胁。目前，全球范围内侵袭性真菌病的死亡率已超过疟疾和乳腺癌，甚至达到与肺结核和艾滋病毒相当的水平。白色念珠菌是侵袭性真菌感染的主要原因，并导致医院感染，死亡率通常超过 40%。然而，目前仅有少数几种抗真菌药物可用于临床，并且大多数都具有严重的副作用。另外，耐药性的迅速出现严重限制了真菌感染性疾病的治疗选择，降低了临床成功率。因此，迫切需要开发具有高选择性和新机制的强效抗真菌剂。然而，与抗菌药物相比，抗真菌药物的开发更具挑战性。因为真菌和哺乳动物细胞都是真核细胞。宿主防御肽 (HDP) 对微生物有效，因为它们具有广谱抗菌活性和对抗菌素耐药性的敏感性。然而，HDPs的应用受到其固有的缺点，例如蛋白水解稳定性差、合成困难和价格昂贵等的极大阻碍。聚合物现在已被探索为HDP的合成模拟物，以寻找有前景的抗菌剂。然而，很少有研究报告有效和选择性的抗真菌聚合物。
为此，华东理工大学刘润辉教授教授团队在细胞穿透肽的启发下，发现含有短的胍基侧链的聚（2-恶唑啉）（POX）作为 HDP 的合成模拟物显示出有效的抗真菌活性以及在治疗局部和全身真菌感染方面的强大治疗效果。该工作以题为“Short Guanidinium-Functionalized Poly(2-oxazoline)s Displaying Potent Therapeutic Efficacy on Drug-Resistant Fungal Infections”发表在《Angew. Chem. Int. Ed.》上。
1 聚合物合成
以三氟甲磺酸盐 (MeOTf) 为引发剂，通过 2-(N-叔丁氧基羰基-γ 氨基丙基)-2-恶唑啉 (ProNHBocOx) 的阳离子开环聚合，并将 NH-Boc 脱保护，可以合成一系列胍基功能化的 POX。通过凝胶渗透色谱，可以获得可变链长 (DP = 5, 7, 10, 20) 和窄分散性 (Đ = 1.08-1.22) 的胍官能化 POX（PGOxn)。
图1. 抗真菌聚合物效果模拟图
图2. 聚合物合成与表征
2 聚合物的抗真菌活性评估
使用最小抑制浓度 (MIC) 评估 PGOxn对多种真菌菌株的抗真菌活性，包括临床分离的致病性白色念珠菌 K1、白色念珠菌 Gu5、白色念珠菌 RK2208、白色念珠菌 RK2911、白色念珠菌 RK2012 和白色念珠菌以及C. neoformans H99。其中六种白色念珠菌都具有对抗真菌药物的抗药性。令人满意的是，可变链长的PGOxn均表现出对白色念珠菌和新型念珠菌的有效活性，最小抑制浓度 (MIC) 值在 0.39-12.5 μg/mL 范围内。PGOxn的抗真菌活性随着聚合物链长的增加而显着提高，直到 PGOx10在 DP = 10 时达到平台期。PGOx10 和 PGOx20 对所有测试的真菌菌株均表现出最佳和有效的活性，MIC 在 0.39-0.78 μg/mL 范围内，优于氟康唑 (FLC) 和强效抗真菌药物两性霉素 B (AMB) 的抗真菌活性。此外，PGOxn 也具有杀菌作用，其最低杀菌浓度 (MFC) 值与相应的 MIC 值几乎相同。
图3. 细胞实验
3 抗真菌选择性
由于真菌和哺乳动物细胞之间的相似性，强抗真菌剂在二者之间的选择性往往较低。然而，在该工作中所设计的一系列聚合物则变现出了优异的抗真菌选择性。使用人红细胞的溶血研究表明，在浓度高达 2000 μg/mL（HC50 > 2000 μg/mL）时，所有 PGOxn的溶血可忽略不计，甚至低于 5%。作者还使用 NIH 3T3 成纤维细胞作为代表性哺乳动物细胞测试了这些 PGOxn 的细胞毒性。所有四种 PGOxn 的细胞毒性（IC50 ≥ 400 μg/mL）均显着低AMB（IC50 ≈ 2.3 μg/mL）。即使在 400 μg/mL 的浓度下，有效的抗真菌 PGOx10 也没有表现出可观察到的细胞毒性。PGOx10 表现出了较好的真菌选择性指数 (SI)，HC50/MIC 的 SI > 2580 以及 IC50/MIC 的 SI > 570。动力学研究表明，在2倍 MIC 的聚合物浓度下，PGOx10 在 60 分钟内杀死了约 99% 的白色念珠菌和新型念珠菌C. neoformans H99，其杀真菌效果略快于 AMB。
4 抗真菌机制
使用延时共聚焦显微镜以及修饰PGOx10的绿色荧光染料（染料-PGOx10）探索了 PGOx10 的抗真菌机制。将该染料和和碘化丙啶（PI，红色荧光）与白色念珠菌和新生念珠菌一起孵育后，染料 PGOx10 首先富集在真菌膜上，随后染料-PGOx10逐渐转移到真菌的细胞质中，导致PI加速富集到细胞质中。表明染料-PGOx10 和真菌膜之间存在温和的相互作用。此外，还观察到染料-PGOx10和 PI之间的高度共定位，这表明 PGOx10的细胞内靶标可能是 DNA 或细胞核。不同的是，即使在 200 μg/mL 的情况下，真菌无活性的富含胺染料-GABA-POX10也不会在白色念珠菌细胞质中富集并杀死真菌细胞，这表明膜穿透对于这些 POX 的抗真菌特性的重要性。通过对细胞核染色，坐着发现该聚合物可以破坏真菌的核膜，并导致线粒体的破坏，核膜和线粒体内部 DNA 被释放到整个细胞质中。此外，PGOx10 与 DNA 紧密结合，与细胞核和线粒体破坏特性相结合，暗示了一种可能的 ROS 相关的抗菌机制。
5 治疗效果
PGOx10 的强效和选择性抗真菌活性鼓励坐着进一步探索其在真菌感染中的治疗潜力，包括皮肤粘膜念珠菌病、白色念珠菌相关角膜炎和全身性白色念珠菌感染。首先，评估了 PGOx10在治疗皮肤黏膜念珠菌病方面的治疗潜力，方法是使用皮肤擦伤感染的小鼠模型，通过局部施用抗真菌剂。在白色念珠菌感染后，盐水处理的对照组表现出严重感染，皮肤真菌负荷为7.05 log CFU/g。PGOx10 治疗将小鼠皮肤的真菌负荷显着降低至 4.97 log CFU/g（与盐水组相比 CFU 减少约 99%），与制霉菌素治疗一样有效。此外，高剂量 PGOx10在小鼠皮肤上的局部应用没有引起明显的局灶性淋巴组织细胞浸润，这表明 PGOx10是安全的，适合皮肤局部给药。
此外，作者还使用鼠真菌性角膜炎模型通过局部给药测试了PGOx10的体内抗真菌效果。盐水处理的眼球显示严重感染，每只眼睛有 4.52 log CFU的真菌负荷。PGOx10治疗将真菌负荷显着降低至每只眼 3.28 log CFU（与盐水对照相比减少约 94% CFU），这与强效抗真菌药物 AMB 一样有效。对小鼠角膜局部施用PGOx10未引起角膜上皮侵蚀，表明 PGOx10 与角膜上皮具有出色的生物相容性。这些研究表明，PGOx10可有效且安全地用于治疗浅表真菌感染。
作者还对两种有前景的抗真菌聚合物进行了药代动力学研究，并证明了 PGOx10的平均血浆消除半衰期（T1/2 = 20.0 ± 6.2 分钟），与 PGOx20的平均血浆消除半衰期（T1/2 = 18.2 ± 5.5 分钟）相当。并且证明了这些聚合物在小鼠体内的安全分布，进一步证明了使用PGOx10进行全身给药在治疗侵袭性真菌感染方面是安全且高效的。
图4. 治疗效果
总结，该工作发现一系列含有不同长度胍基侧链的聚合物具有优良的抗真菌活性，并表现出优异的抗真菌选择性以及抗真菌治疗效果。本研究中的策略为其他类型的抗真菌剂的设计提供了借鉴。
