泰利三佳纳米离子银表征及杀菌性能分析

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许晓东[1]^,3，郭锋利¹，谈智²，陈越英²
（1. 苏州邦安新材料科技有限公司   江苏•苏州2. 江苏省疾病预防控制中心 江苏•南京
3. 苏州泰利三佳纳米科技有限公司 江苏•苏州）
摘要：目的 测定泰利三佳纳米离子银毒性及杀菌效果。方法 卫生部《消毒技术规范(2002)》急性经口毒性试验消毒剂杀微生物试验。结果 泰利三佳纳主离子银属无毒级，可在10分钟内对大肠杆菌及白色念珠菌杀灭率大于99.999%，对金黄色葡萄球菌在20分钟内杀灭率大于99.999%。结论 泰利三佳纳米离子银符合卫生部消毒剂杀菌要求。
关键词：泰利三佳纳米离子银；消毒；细菌；真菌
 
Characteristics and Sterilization Capability of Aima Nano-Silver Disinfectant
Xiaodong Xu, Fengli Guo, Zhi Tan, Yueying Chen
(1. Suzhou Bangan New Material  Sci-Tech Co, Ltd 2. Souzhou Aima Nano Sci-Tech Co, Ltd
3. Jiangsu Province Center of Disease Prevesation and Control)
Abstract: Objecitve To evaluate the toxicity and the disinfection effect of Aima Nano-silver disinfectant. Methods Suspension quantitative germicidal test and toxicity test were used to evaluate the active of disinfectant according to the disinfection technical guidelines (2002). Results The mouse acute oral lethal dose 50% (LD50) more than 5000 mg/kg shown that Aima Nano-silver disinfectant is non-toxic. The killing rate of Escherichia coli and Monilia albican exposed in Aima Nano-silver disinfectant for 10 min is more than 99.999%, and the same killing rate to Staphyloccocus aureus is 20 min.
  Key words: Aima Nano-silver disinfectant, toxicity test, suspension quantitative germicidal test
 
自然界的有害细菌、真菌和病毒等微生物是使人类传染、诱发疾病的主要原因。近年来随着人人类活动交流频繁，人口密度增大，不仅传统微生物引起病害增加，而且还出现了新的微生物引起流行病。1995年在日本全国范围内的病原性大肠杆菌0-157，20世纪未到本世纪初在英国的疯牛病，口蹄疫、美国的炭疽病、2003年春夏出现的严重急性呼吸道感染综合症(SARS)以及今年席卷全球的H1N1流感，这些传染病都由微生物传播引起。世界健康组织（WHO）2009年公布世界范围内，每10人死亡中，就有3人死于微生物引起的传染性疾病（http://www.who.int/whosis/en/index.html）。
目前人们实践中消毒使用的主要是过氧化物类消毒剂和含氯消毒剂。这两类消毒剂都具有刺激性气味，浓度过高或使用过频容易引起鼻腔、嗓子发炎，咽喉肿痛。从上世纪70 年代以来，国际上相关研究已证明，这些消毒剂在消毒时产生的有机氯化物，如一氯甲烷、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯甲烷等，会对人体健康造成危害。另外，过量的消毒剂直接或间接进入空气、水体、土壤后，不仅造成二次环境污染，还破坏了空气、水体、土壤等环境介质的生态平衡，对环境造成危害^[1,2]。银属于天然矿质元素，具有无毒无味，对环境较安全等优点，本文对苏州泰利三佳纳米科技有限公司生产的新型纳米离子银杀菌剂进行表征及杀菌性能分析，为其产品化应用提供参考。

1．材料与方法
1.1 泰利三佳纳米离子银表征及口服毒性分析：
泰利三佳纳米离子银（离子银含100 µg/ml）由苏州泰利三佳纳米科技有限公司提供。利用扫描及透射电子显微镜颗粒尺寸大小表征。SEM试样制备用无菌吸头吸取0.2 ml样品液体于一干净病盖玻片上，自然风干后，喷金，置于扫描电子显微镜（JSM-5600LV）下观察。 TEM试样制备方法为将一滴银溶液滴到覆盖有碳膜的铜网上，然后将溶液蒸干，置于透射电子显微镜（Hitachi，H800）下观察。
口服毒性实验实验用KM小鼠体重18g～22g，共20只，雌雄各半，分为5000 mg/kg组和蒸馏水对照组。本实验按0.1 ml/20g灌胃，具体操作步骤参考《消毒技术规范（2002）》2.3.1，复旦大学动物实验中心测定。
1.2 泰利三佳纳米离子银杀菌性能分析
1.2.1 实验用菌：金黄色葡萄球菌（ATCC6538）第6代，大肠杆菌（8099）第6代，白色念珠菌（ATCC10231）第6代。（此三种菌株全部军事医学科学院消毒检测中心提供）
1.2.2 中和剂鉴定实验
     细菌实验中中和剂成份为：0.2%乙二胺四乙酸二钠、2%卵鳞脂、4％吐温80的TSB   实验菌种为金黄色葡萄球菌（ATCC6538），作用时间为5 min。
    真菌实验中中和剂成份为：0.4%乙二胺四乙酸二钠、4%卵鳞脂、6％吐温80的TSB   实验菌种为白色念珠菌（ATCC10231），作用时间0.5 min。
实验分组如下：
第1组  消毒剂 + 菌悬液 →培养  
观察消毒剂对试验菌有无杀灭或抑制能力。
第2组  （消毒剂 + 菌悬液） + 中和剂 → 培养
观察残留消毒剂被中和后受到清毒剂作用后的试验菌是否能恢复生长。
第3组  中和剂 + 菌悬液 → 培养
观察中和剂是否抑菌。
第4组  （消毒剂 + 中和剂）+ 菌液 → 培养
观察中和产物，或未被完全中和的残留消毒剂对试验菌的生长繁殖是否有影响。
第5组  稀释液 + 菌悬液 → 培养
作为菌数对照。
        具体实验操作过程参考《消毒技术规范（2002）》2.1.1.5。
1.2.3 定量杀菌实验
1.2.3.1 实验用菌：金黄色葡萄球菌（ATCC6538）第6代，大肠杆菌（8099）第6代，白色念珠菌（ATCC10231）第6代。（此三种菌株全部军事医学科学院消毒检测中心提供）
1.2.3.2 用原液及稀释50倍做杀菌实验分析，有机干扰物为BSA 3%。具体操作步骤见2.1.1。

2．结果
2.1 泰利三佳纳米离子银颗粒尺寸
通过扫描及透射电子显微镜观察，其颗粒分布见图1。从图1左右两图都可看出，泰利三佳纳米离子银产品溶液为球状颗粒，尺寸均小于10 nm，完全条符合纳米材料要求。从透射照片可以看出，有大量5nm及以下颗粒，表明合成的离子银属于零维纳米材料。

图1. 泰利三佳纳米离子银粒径 （左：扫描电镜图 右：透射电镜图）
Figure 1 Particle size of Aima Nano-Silver（Left: SEM   Right: TEM）
2.2 泰利三佳纳米离子银口服毒性
实验泰利三佳纳米离子银处理和蒸馏水对照用20只小鼠在实验14天内，无体重下降及中毒现象出现，无死亡。故LD₅₀>5000 mg/kg。
2.3 中和剂鉴定实验
泰利三佳纳米银中和剂实验对于细菌和真菌成份相同，但对于真菌浓度更高些。从表1可以得出，没有中和剂影响，泰利三佳纳米离子银可在5分钟内全部杀死供试金黄色葡萄球菌，中和剂终作用后可在5分钟内将大于99.9%的菌杀死。表2可以得得出，没有中和剂影响，泰利三佳纳米离子银可在30钞内全部杀死供试白色念珠菌，中和剂终作用后可在30秒内将大于99.9%的菌杀死。
表1  杀细菌中和剂鉴定试验结果

组别	每次实验菌落数（cfu/ml）			平均生长菌落数（cfu/ml）
	1	2	3
1	0	0	0	0
2	1.95×104	3.05×104	1.06×104	1.11×104
3	3.20×107	3.00×107	2.35×107	2.85×107
4	2.45×107	2.85×107	2.25×107	2.52×107
5	3.40×107	3.25×107	3.05×107	3.23×107

 
表2  杀真菌中和剂鉴定试验结果

组别	每次实验菌落数（cfu/ml）			平均生长菌落数（cfu/ml）
	1	2	3
1	0	0	0	0
2	1.45×103	1.26×103	8.75×102	1.20×103
3	2.05×106	2.50×106	3.20×106	2.58×106
4	2.35×106	2.95×106	3.55×106	2.95×106
5	2.70×106	3.45×106	4.40×106	3.52×106

 
2.4 定量杀菌实验
以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌分别为革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌代表，测验泰利三佳纳米离子银对这三类微生物杀菌效果（表3）。 按卫生部行业标准方法检测，泰利三佳纳米离子银可在10分钟内对大肠杆菌和白色念珠菌达到消毒要求，在20分钟内对金黄色葡萄球菌达到消毒要求。
表3 泰利三佳纳米离子银对测定微生物杀灭效果

菌种	对照	作用时间（min）
		10	20	30
金黄色葡萄球菌	7.21 (7.24-7.30)	3.52 (3.17-4.07)	>5.00	>5.00
大肠杆菌	7.45 (7.39-7.54)	>5.00	>5.00	>5.00
白色念珠菌	6.45 (6.36-6.53)	>4.00	>4.00	>4.00

注：表中所得数据为三次独立实验平均值

3．讨论
目前国际上公认的理想消毒剂的标准是杀菌效果好并且稳定，安全环保，微生物不易产生抗性。毋容置疑，目前消毒作用时间短效果好的还是含氯消毒剂，但是此类消毒剂对人有毒，对环境有害，不适合于长期应用特别是家庭日常生活用品消毒上。
在《消毒技术规范（2002）》中，将银汞铜等金属离子消毒剂为低水平消毒法，认为银不能按该标准杀灭真菌。因此无机杀菌剂目前主要应用在抗菌领域，如水处理，织物抗菌等^[3]。但现在人们研究发现，不同价银杀菌能力不同，随着价位提高银的杀菌能力大大增强，三价银的杀菌能力是银的50-200倍。泰利三佳纳米离子银采用的是三价银氧化物，具有极强的杀菌能力，打破了纳米银属于低水平消毒剂这一传统观念。
本研究的另一个有趣之处在于：传统杀菌剂都是真菌杀灭难度大于细菌，而本研究相反，泰利三佳纳米离子银杀白色念珠菌能力远大于对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。这可能是由于纳米银与传统酒精及含氯消毒剂杀菌机理不同，传统消毒剂作用于细胞，相当于“群殴”式杀菌^[4]，对于小个体的对付易于大个体；而银离子杀菌机理^[5]是与细菌接触反应，造成细菌固有成分被破坏或产生功能障碍从而导致细菌死亡。由于微生物的细胞膜常带有负电荷，银离子能依靠库伦引力牢固吸附在细胞膜上，而且银离子还能进一步穿透细胞壁进入细菌内，并与细菌中的巯基反应，使细菌的蛋白质凝固，破坏细菌的细胞合成酶的活性，使细胞丧失分裂增殖能力而死亡，属于“攻击”式。对于个体大的真菌的接触机率大于个体小的细菌，因此银离子杀真菌能力大于对细菌的。
银自古以来就认为对人无毒，刘敏等^[6]测试了纳米银抗菌凝胶剂毒性，认为该材料属实际无毒物，无致突变作用，对家兔皮肤无刺激性，对黏膜具极轻刺激性，这也与本文研究相一致。泰利三佳纳米离子银经测试后杀菌效果好，无毒，无色，无味，同时由于银为无机天然元素，可在环境中循环，对环境无压力。因此可广泛应用于污水处理厂、宾馆、医院、学校等公共场所，也可应用于家庭厨房、衣服、生活用具等方面，具有广阔的应用空间。
 
参考文献：

1. Nieuwenhuijsen, M.J., M.B. Toledano, and P. Elliott, Uptake of chlorination disinfection by-products; a review and a discussion of its implications for exposure assessment in epidemiological studies[J]. J Expo Anal Environ Epidemiol, 2000. 10: 586-599.
2. Nieuwenhuijsen, M.J., et al., Chlorination disinfection byproducts in water and their association with adverse reproductive outcomes: a review[J]. Occup Environ Med, 2000. 57(2): 73-85.
3. 古一雯, 李临生, 罗唬捷. 消毒剂研究新进展[J]. 中国消毒学杂志, 2008. 25(1): 70-73.
4. 韩磊. 几种消毒剂的消毒机理及比较[J]. 河北化工, 2003(3): 19-20.
5. 肖清华, 李博文, 王宁. 载银无机抗菌剂的研究现状和发展趋势[J]. 中国非金属矿工业导刊. 1999(6): 5-7.
6. 刘敏, 胡嘉想, 秦光和, 樊丽惠, 王伟, 景箫. 纳米银抗菌凝胶剂的毒理学评价[J]. 中国消毒学杂志, 2010. 27(3): 260-262.