表面固定化防疫涂层及抗病毒试验

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王渊[1] 王雪平[2]
（1太原理工大学 2江苏迅扬环保新材料有限公司 2山西巴盾环境保护技术研究所）

[摘要]  目前，国内外有关表面自洁性抗（抑）菌产品与技术已经非常普遍，且种类繁多，常见的有金属银离子、光触媒、有机硅季铵盐、光动银及其它抗菌化合物等，产品应用包括涂料、涂层、纺织品、塑料、化纤、玩具等。但是，具有表面抗病毒或灭菌作用的产品技术未见报道。

一、技术背景
 大量实验证明，国内外现有表面抗（抑）菌产品仅对细菌繁殖体具有有限的抑制作用，抗生效能低下，不能满足污染严重或高危环境的防疫要求，比如P3、P4高等级生物安全实验室、军事防护、病毒性污染的防护。
我们知道，世界唯一的医用灭菌剂戊二醛于1908年由美国Harries和Tank合成，至今已有 100年的历史。
针对现有戊二醛灭菌剂一次性作用的不足，以及现有自洁性表面抗（抑）菌产品效能及应用的局限性，王雪平等于1999年发明了氨基2，4氯代1，5戊二醛（灭菌剂），2001年获得国家发明专利，专利号ZL 97100529.X。
2011年，王渊等采用氨基2，4氯代1，5戊二醛研制成功《表面固定化灭菌涂层》。实验表明：作用8h，2，4氯代戊二醛对乙肝病毒具有灭活作用。作用20min，对SARA病毒灭活率达100%。 
另外，将氨基2，4氯代1，5戊二醛涂于物表固化，可使表面产生持久的防疫作用，在控制突发性高危传染病事件、传染病医院、军事防化及职业防护方面，具有不可替代的应用价值。

二、  表面抗病毒涂层（整理剂）及试样的制备
1、灭菌材料的制备
表面抗病毒涂层（整理剂）系采用一步法合成工艺，于90-130℃反应釜中制成，主要成分为氨基树脂和2，4氯代1，5戊二醛（详见中国发明专利专利号ZL 97100529.X 公开说明书），由江苏迅扬环保新材料有限公司生产。采用喷涂或浸渍方法，可制得抗病毒纺织品试样。除外，亦可将表面抗病毒涂层喷涂于物体表面，制得抗病毒表面。
2、病毒灭活试验材料
    （1）小牛血清（56℃，30min灭活）；
    （2）0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.2-7.4）；
    （3）纯化HBsAg(1.0mg/0.17mL)（北京生化免疫试剂中心）；
    （4）中和剂：10％小牛血清、0.5％卵磷脂、1％吐温80的0.01mol/L PBS
溶液；
    （5）酶联免疫吸附试验试剂盒（灵敏度为2.0ng/mL）；
    （6）酶联免疫吸附测定仪（美国 B10-RAD450）；
    （7）低温冰箱（–20℃）；
    （8）植物夏枯草卫生整理剂。
3、试验方法
   3.1 试验用HBsAg的制备
    采用含小牛血清的PBS，将HBsAg稀释成浓度为 100μg/mL、含5%小牛血清的HBsAg悬液，置于–20℃的冰箱中备用。
3.2试样及空白对照的制备：
用含0.6％吐温80的无菌蒸馏水，将有效成分含量为10％的氨基2，4氯代1，5戊二醛放入均质乳化机内，制备成浓度为0.1％的乳化液，备用。
3.3试样的制备
将1cm×1cm规格的纯棉毛巾浸于浓度为0.1％的释液中2min，离心脱水，同时控制试样的带液量为90％；经120℃干燥20min，制得受试样品，备用。最后，以无菌操作，用灭菌剪刀将试样（毛巾）与未经药物处理（即不含抗病毒成分）的空白对照毛巾，分别裁成1 cm×1cm大小的样片，置于无菌试管内备用（1片/支）。
4、中和剂鉴定试验
    第1组：将HBsAg悬液20μL滴加于WXP试样上，将试管置于20±2℃水浴中，作用3h，加入1mL含10％小牛血清的PBS，浸泡10min。振荡试管，洗下HBsAg，一式两份，各取样0.1mL进行检测。
    第2组：将HBsAg悬液20μL滴加于试验样片上，将试管置于20±2℃水浴中，作用3h，加入1mL含10％小牛血清中和剂溶液的试管中，浸泡10min。振荡试管，洗下HBsAg，一式两份，各取样0.1mL进行检测。
    第3组：将HBsAg悬液20μL滴加于空白对照片上，将试管置于20±2℃水浴中，作用3h，用灭菌镊子将污染HBsAg的空白对照片加入含1mL中和产物溶液的试管中，浸泡10min。（中和产物溶液的制备，是在每片试验样片中加入1mL中和剂溶液，振荡混匀，中和10min。）振荡试管，洗下HBsAg，一式两份，各取样0.1mL进行检测。
    第4组：将HBsAg悬液20μL滴加于空白对照样片上，将试管置于20±2℃水浴中，作用3h，加入1mL中和剂，浸泡10min。振荡试管，洗下HBsAg，一式两份，各取样0.1mL进行检测。
    第5组：将HBsAg悬液20μL滴加于空白对照样片上，将试管置于20±2℃水浴中，作用3h，加入1mL含10％小牛血清PBS溶液，浸泡10min。振荡试管，洗下HBsAg，一式两份，各取样0.1mL进行检测。
    第6组：向含有一试验样片的试管内加入1mL中和剂，中和10min，振荡混匀，取样0.1mL进行检测。
    第7组：向含有一试验样片的试管内加入1.0mL 10％的PBS溶液，振荡混匀。一式两份，各取样0.1mL进行检测。
    第8组：取0.1mL试验用、含10％小牛血清的PBS溶液，一式两份，以备检测。
5、HBsAg破坏试验方法
将样片放于无菌试管内（勿使样片中央与试管底部接触），试管上分别标记“试验浓度”和“作用时间”。每个浓度和作用时间各取两个样片，将盛有样片的试管，置于20±2℃水浴内10min，然后用微量移液器吸取HBsAg悬液20μL，滴于样片中央。待作用至规定时间后，向试管内加入1mL中和剂，进行检测。每一剂量检测2个样本，取两个试样的平均OD值计算S/N值。
阴性空白对照为一片1 cm×1cm试样加1mL中和剂，作用10min的中和产物；阳性空白对照为1mL中和产物加污染HBsAg的空白对照片1片，污染HBsAg时间和试验组作用时间相同。阴、阳性空白对照，每个时间各取3个样本，检测与试验组相同。
（注：按照卫生部1999年版《消毒技术规范》病毒灭活实验方法规定，S/N值小于2.10为阴性。）
6、  试验结果
6.1  中和剂鉴定试验结果
参见表1，经3次重复试验，第1组S/N值为1.35，第2组S/N值为5.59，第3、4、5组的S/N值分别为253.93、260.67、259.22，按照卫生部2002版《消毒技术规范》中和剂菌落数误差率计算公式，得第3、4、5组之间的误差率均为1.04％。由此证明，所用中和剂可有效中和残留抗病毒剂对织物表面上HBsAg抗原性的破坏作用，且中和剂和中和产物对HBsAg的抗原性及检测系统无明显影响。
 
                              表1  中和剂鉴定试验结果              
组别        平均S/N值       试验值范围
    1              1.35              0.85-1.45
    2              5.59              3.56-9.00
    3             253.93          159.00-464.70
    4             260.67          162.26-467.30
    5             259.22          168.11-458.90
    6              1.00
    7              0.96              0.89-1.00
    8              0.97              0.78-1.18
 
6.2  试样对HBsAg表面抗原的破坏结果
    参见表2、表3，3次重复试验结果表明，经表面抗病毒涂层剂整理后的织物与HBsAg悬液作用8h之后，S/N值分别为1.74、1.50和2.06，均小于2.10，均为阴性。
 
表2  织物试样对HBsAg抗原性的破坏效果                
试验次数      不同作用时间(min)平均S/N值及范围    阴性空白对照平均
值及其范围
 
                    5         10          30         60          OD
   1           40.50        23.06        11.89        8.00                 0.009
                                                                                 （0.006-0.010)
   2           33.67        19.72        10.89        8. 72                0.009
                                                                                   (0.006-0.010)
   3           31.22        14.61        11.44        6.44                  0.009
                                                                                   (0.006-0.010)
阳性空白对照  226.78       253.89       233.22      230.89                 0.009
S/N值 223.89-233.67  233.89-269.78  223.33-254.45 209.78-261.89             (0.006-0.010)
 
 
表3  织物试样对HBsAg抗原性的破坏效果           
试验次数   不同作用时间(min)  平均S/N值及范围     阴性空白对照平均
120       240        360        480       OD值及其范围
  1         3.55         2.87         2.29         1.74                 0.008
                                                                               (0.007-0.009)
   2           3.05         2.25         2.15         1.50                 0.005
                                                                   (0.004-0.006)
   3           2.69         2.56         2.19         2.06                 0.008
                                                                               (0.006-0.009)
阳性空白对照  132.74      82.20         61.96       51.31
S/N值       95.73-169.75  80.27-74.13    56.55-67.37    46.62-56.00
 
 

7、结论
经表面抗病毒涂层处理后的织物试样（毛巾），按照卫生部1999年版《消毒技术规范》病毒灭活实验方法，与HBsAg悬液作用5min之后，HBsAg量明显减少；作用至8h，S/N值小于2.10。而不含表面抗病毒涂层的空白对照试样，与HBsAg悬液作用1 h之后， S/N值无明显改变。随着时间的延长，S/N值有下降趋势，但至8 h之后，S/N值仍为51.31。由此判断，经表面抗病毒涂层处理后的试样，对HbsAg乙肝抗原具有破坏作用。
（注：按照卫生部1999年版《消毒技术规范》病毒灭活实验方法规定，S/N值小于2.10为阴性。）

三、Sars病毒灭活试验
武汉大学现代病毒研究中心按照卫生部《消毒技术规范，2002 版》中2.1.1.10.1-2.1.1.10.8 病毒灭活试验规范，对江苏迅扬环保新材料有限公司生产的防疫涂层（乳液）进行Sars病毒灭活试验，结论如下：

1. 中和剂原液10^-2稀释对受试 (Vero E6) 细胞毒性极低，可用于正式试

验中的中和测定。
（2）10^-2稀释的乳液对细胞具高度毒性，不能直接用于病毒的灭活试验。
（3）10^-2稀释的中和剂加10^-2稀释乳液的中和产物对细胞无毒性，不影响中和测试。
（4）防疫涂层（乳液）可使Sars病毒灭活，但如不用中和剂中和接种宿主
细胞，将产生细胞毒性，出现假阳性结果。
（5）10^-2稀释的防疫涂层（乳液）与Sars病毒作用10分钟，灭活效率达～
32%，灭活对数值小于4.0；
（6）10^-2稀释防疫涂层（乳液）20分钟可灭活测试Sars病毒，效率100%，
灭活对数值6.5；
（7）在本试验条件下，10^-2稀释的防疫涂层（乳液）作用20分钟灭活Sars
病毒的效率达卫生部消毒技术规范标准，实验室试验合格。
 
 
 参考文献：
[1]  姚鼎山.环保与健康新材料——托玛林[M].北京：中国纺织大学出版社，2001.125.
[2]  姜勇, 丁恩勇 , 黎国康.化学改性纤维素固态相变材料的热性能研究[J].纤维素科学与技术，2000，8（3）：8-13.
[3]  郑庆康，朱谱新.反应性阳离子化剂的合成[J].印染助剂，2001，18（4）：5-8.
[4]  卫生部2002版《消毒技术规范》[M] ，2002：23
[5]  抗病毒滴丸抗病毒作用的实验研究《中国实验方剂学杂志》 2007年06期. 付萍  杨铭  陈颖丽  李伟等  
[6]  抗病毒1号中药有效部位抗流感病毒FM1的实验研究 《中华流行病学杂志》2002.9.23李洪源 常曼丽等