抗菌实验不同操作方法及细节对试验结果的影响

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赵春艳，王 静，冀志江，王晓燕
（中国建筑材料科学研究总院  绿色建筑材料国家重点实验室，北京 100024）

摘要：本文参照ISO 22196-2011《 塑料和其它无孔表面抗菌活度的测量》标准，对硬质非吸水性材料进行抗菌试验，通过比浊法、分光光度计法、经验法确定菌液浓度的大小，分析探讨了接种方法对抗菌实验结果的影响，铺设菌液量的多少及样品培养环境的湿度等实验细节的不同对抗菌结果的差异，为后续抗菌实验提高测试的准确性。
关键字：抗菌实验；菌液量；比浊法；接种方法

随着生活水平的提高和科技的发展，人们对很多材料和制品提出不仅要满足其正常的使用性能，而且要增加如抗菌、净化这样的环境性能，因此具有抗菌功能的陶瓷砖、塑料板、涂料、木地板等各种制品被大量研发应用。国内外也相应推出各类抗菌制品的产品标准或方法标准，目前被广泛应用的标准有《塑料和其它无孔表面抗菌活度的测量》（ISO 22196-2011）、《抗菌涂料》（HG/T3950-2007）、《抗菌针织品》（FZ/T 73023-2006）等。2012年中国抗菌协会依据ISO 22196标准组织了中日抗菌比对实验，中科院理化所、广东微生物研究所、建材纺织行业检测中心及日本抗菌机构等8家实验室参加了此次比对。虽然依据同一标准方法，使用统一的菌种、琼脂、水等实验材料，但实验室间的结果还是有差异的，而且有的偏离较大。抗菌实验结果受多种因素的影响，如实验菌种的活度、营养琼脂等材料的功效、菌液浓度的控制、实验条件的设置、操作细节的差异等。
目前在抗菌实验的具体方法、实验细节对结果影响方面还没有研究报道，本文依据ISO 22196-2011实验方法，以陶瓷为试验样品，通过实验中不同操作细节的比较，分析探讨了抗菌实验不同操作方法及细节对试验结果的影响。

1实验材料及仪器
1.1 菌种
大肠杆菌AS1.90，金黄色葡萄球菌AS1.89（中国科学院微生物研究所菌种保藏中心提供）
1.2实验材料及样品
实验材料：营养琼脂（北京双旋微生物公司提供）、聚乙烯覆盖膜、0.85%生理盐水（自制）、1/500培养液、1/100培养液（自制）；
实验样品：陶瓷砖试片及空白对照样片，5cm×5cm，各50片（福建某厂家提供）
 
1.3 试验仪器
超净工作台、紫外-可见分光光度计、高压蒸气灭菌器、恒温恒湿培养箱、旋涡震荡器、冰箱等[1]

2实验方法
整体实验依据ISO 22196-2011《 塑料和其它无孔表面抗菌活度的测量》中的规定。
2.1菌液浓度的确定
2.1.1比浊法
取连传两代的大肠杆菌斜面，用接种环从斜面上刮取1-2环新鲜的细菌，加入培养液，与细菌标准比浊管浓度对比，相同即为10⁸浓度，并依次做10倍递增稀释，从10³稀释度中取0.1ml涂布法接种、培养、活菌计数，可计算出初始菌液的浓度C。
2.1.2分光光度计法
将从斜面上刮取的活化的细菌，加入培养液，并进行适当的稀释，取3ml菌液放入比色皿中，在UV2800紫外可见分光光度计中，以1/500的培养液为参比液，波长600nm条件下测试吸光度，得到的吸光度值ABS与比浊法得到的菌液浓度C值进行比较。
2.1.3 经验法
该方法是具有实验经验的操作人员通过目测菌液的浊度，直接取适当量的菌液进行逐级稀释，以活菌计数来判定初始菌液浓度的准确性。
2.2  细菌的接种
细菌的接种方法有很多，如划线法、涂布法、平板倾注法、斜面接种法、液体培养基接种法等，本文对实验室常用的涂布法和平板倾注法进行实验比较。
涂布法是将细菌培养基做成培养基平板，将稀释到一定浓度的菌液滴到平板上，用L涂布棒涂布均匀。将涂抹好的平板平放于工作台面20-30min，使菌液渗透到培养基内，然后放置在37℃的恒温培养箱中培养24h-48h，再进行活菌计数。
平板倾注法是将45-50℃左右的液体培养基倒入装有一定菌液浓度（菌液量一般为1ml)的
平皿中, 37℃的恒温培养箱中培养24h-48h，对菌落数为30-300的培养皿进行菌落计数。
 
2.3  样品菌液量的铺设
对硬质非吸水型样品，在表面铺设的菌液量对实验结果会产生影响。本文分别用0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml的大肠杆菌的菌液量铺在抗菌陶瓷试样表面，覆盖上聚乙烯膜，在平皿中放入1ml盐水，以增加单个平皿中的湿度，在37℃、 90%湿度下培养24h，然后用10ml盐水对样品表面进行充分冲洗，用涂布法接种，培养，活菌计数。

3结果与讨论
3.1 菌液浓度确定的几种方法比较
    用分光光度计测得的吸光度值和比浊法、经验法测得的菌液浓度的数值，见表1，几种方法的对应关系见图1和图2.
表1  菌液浓度值与吸光度值的比较

序号	吸光度（ABS值）	比浊法菌液浓度（cfu/ml）	吸光度（ABS值）	经验法菌液浓度（cfu/ml）
1	0.089	7.1×107	0.093	9.5×107
2	0.165	2.7×108	0.308	4.0×108
3	0.14	2.2×108	0.134	1.87×108
4	0.123	1.6×108	0.23	4.35×108
5	0.225	4.1×108	0.361	5.1×108

图1  吸光度与菌液浓度的关系（比浊法）          图2  吸光度与菌液浓度的关系（经验法）

分光光度计法的测试原理是光线通过微生物悬液时，由于散射或被吸收而降低透过率，因此悬浮液中细胞密度与光密度（OD值）成正比，即与吸光度成正比。这种方法用于微生物的科研实验较多，是一种较快捷的测试菌悬液浓度的方法。但在定量测试材料抗菌性能实验时，很少用到此方法。本实验的目的是想找到分光光度计法和比浊法、经验法测试的数值间的对应关系，以便后续抗菌实验时这几种方法能通用。
从表1的结果看，比浊法和分光光度计法进行了5次对比实验，用比浊法测试的菌液浓度只有1次大于4×10⁸cfu/ml，其余4次数值都利于阴性对照的计数，吸光度值与比浊法菌液浓度值作图（如图1），得到两者线性关系良好，R² = 0.9948，回归系数R接近1，说明两种方法测试结果可比性强。经验法和分光光度计法也进行了5次对比实验，发现经验法测出的菌液浓度值多偏高，5个数据有3个大于4×10⁸ cfu/ml，实验测出的吸光度值与经验法测出的菌液浓度值作图（如图2），发现两者线性关系不很好，R² = 0.8847，5次试验中有2次实验结果离散性较大。从两组实验看，ABS值在0.1-0.2之间时，菌液浓度在（1-4）×10⁸ cfu/ml之间，ABS值＞0.2时，菌液浓度在（4-6）×10⁸cfu/ml之间，ABS值＜0.1时，菌液浓度在（7-10）×10⁷ cfu/ml之间。当菌液浓度大于4×10⁸cfu/ml时，阴性对照不易计数，且与样品作用的菌量多；当菌液浓度小于1×10⁸ cfu/ml时，整体菌的浓度低，则与样品作用的菌量少，菌量过多或过少都会影响样品与菌的作用及最终抗菌性能的评判。通过以上实验即可得到在配制菌悬液时，直接用分光光度计测试ABS值在0.1-0.2之间时，则为所需要的（1-4）×10⁸ cfu/ml范围的菌浓度，而不用再通过菌液接种培养后计算出菌液浓度，实验过程中即可直接控制菌液浓度的高低了。
3.2 接种方法的比较
分别用涂布法与平板倾注法测试了空白阴性的菌落数及陶瓷样品活菌数、抗菌率、染菌率间的差异，如下表2.
表 2  涂布法与平板倾注法的抗菌结果比较

性能测试		涂布法			平板倾注法
		第1次	第2次	第3次	第1次	第2次	第3次
空白阴性活菌数,cfu/ml		1.88×105	2.02×105	1.89×105	1.13×105	1.04×105	1.19×105
抗菌样品活菌数,cfu/ml	样品A	10	10	500	10	10	625
	样品B	7900	8750	9400	7400	7780	7750
	样品C	10	10	62	10	10	10
抗菌率，%	样品A	99.99	99.99	99.73	99.99	99.99	99.47
	样品B	95.80	95.67	95.03	93.45	92.52	93.49
	样品C	99.99	99.99	99.97	99.99	99.99	99.99
染菌率，%		高			低

 
    
图3  蔓延菌落的平板              图4 正常菌落的平板
选择了3种实验样品A、B、C,每个样品分别做了3次试验，每次试验中，做了3个平行平板。从表2可看出，针对同一样品，两种方法测的抗菌率的差异不大，但是涂布法的染菌率稍高，该实验中3个样品使用平板数量是27个,涂布法操作时，3个平板有染菌，而使用平板倾注法时，没有染菌，所以在菌落计数时，倾注法更能提高数据的准确性。从操作的便捷性来看，涂布法比平板倾注法节省平皿、试管的的使用量，为实验人员节约清洗器皿的时间，平板倾注法操作相对简单、快捷且影响因素较少。并且培养基营养分布较均匀，对部分蔓延菌落能控制(如图3、图4示)，但对操作人员熟练程度要求相对较高。在实际工作中，大家可根据个人的操作习惯，选择一种适合自己的方法。
3.3 不同菌液量的比较
    在对硬质非吸水型样品进行贴膜法抗菌实验时，发现滴加的菌液量不同会影响实验结果，本实验选择2个抗菌陶瓷砖样品，铺设4个浓度的菌液量，测的样品的抗菌率及抗菌活性值，结果如下表3.
表 3不同菌液量的结果比较

菌液加量	样品D			样品E
	活菌数,cfu/ml	抗菌率，%	抗菌活性值，R	活菌数,cfu/ml	抗菌率，%	抗菌活性值，R
0.2ml	0	99.99	3.7	0	99.99	3.7
0.3ml	4.9×102	98.80	1.9	2.7×103	93.84	1.2
0.4ml	1.0×106	0	0	6.3×104	36.0	0.19
0.5ml	1.0×106	0	0	1.0×106	0	0

 
从表3的结果看，铺设0.2mL菌液量时，样品D 和E的 抗菌率都是99.99%，但在实验中发现铺上菌液在37℃、 90%RH下作用24h后，样品表面菌液已干，所以实验结果会受到菌液表干、菌自然死亡率高的影响。而铺设0.4ml和0.5ml菌液量后，抑菌率都不好，特别是铺设0.5ml的样品，两个样品抑菌率都是0。实验中还发现，铺设0.5mL菌液时，会有菌液流出样品表面的现象，造成实验误差。其次发现这样多的菌液铺上塑料膜作用24h后，菌液还是有一定的厚度，因为抗菌样品多是依靠菌与样品表面的抗菌物质接触后与细菌起作用的，所以有一部分菌液会接触不到抗菌样品表面，而未被作用，因此抗菌结果受到影响。而铺设0.3ml菌液作用24h后，表面未有表干，抗菌率也都在90%以上。从实验结果看，在硬质非吸水性材料铺设菌液量在0.3ml时最适宜，能够真实反映材料实际抗菌效果。
3.4其他因素
湿度也是影响样品抗菌结果的一个因素。按照标准要求，菌液铺设到样品表面后，放到37℃、 90%湿度中培养24h，恒温恒湿箱的温度控制一般通过加湿器或湿球来达到。该实验中通过加湿器控制湿度在90%左右，但是结果发现，24h后样品表面还是容易表干，因为恒温恒湿机在工作时，会对箱体内部鼓风，只靠加湿器的湿度，远不能满足要求，增加补救措施是必要的，可在仪器内部放置一托盘水，或在平皿底部放置无菌纱布和水，以提高湿度。
材料本身的性能也是影响因素之一。比如有的样品亲水性强，有的样品憎水性强，菌液滴加后，可能会溢出样品表面，这时就要采取一定措施抑制菌液流出。
4总结
影响硬质非吸水性抗菌制品的抗菌性能测试结果的因素很多，如菌的活度、菌液浓度、菌液作用量、实验室温湿度控制、样品本身的性质等等。通过比浊法、分光光度计法、经验法确定菌液浓度，实验发现比浊法测得的菌液浓度值与的吸光度有很好的线性关系，吸光度在0.1-0.2之间时，对应的菌液浓度在（1-4）×10⁸cfu/ml范围，因此可通过测试吸光度值，直接控制菌液浓度高低，提高实验的准确性。细菌常用的接种方法有涂布法和平板倾注法，实验中发现这两种方法得到的结果差异不大，但涂布法染菌率高于平板倾注法。
菌液量过多或过少都会对抗菌结果产生一定的影响，实验发现铺设到硬质非吸水性抗菌制品的菌液量以0.3ml最适宜；控制培养环境的湿度，也很关键；各实验室检测条件、检测人员、检测设备、实验方法的不同，也都会造成实验结果的差异。总之影响抗菌实验结果的因素很多，只有通过不断的、细致的实验来提高抗菌测试的准确性。
 
参考文献
[1]. 朱艳静,李宇. 测试菌体浓度的简便方法[D].工业微生物, 2006.12
[2]. 王志义.抗菌陶瓷研究现状及发展趋势[D].中国陶瓷工业，2006.6
[3]. 刘晓蓉主编.微生物学基础[M].中国轻工业出版社，2011.8
[4]. 杜连祥等. 工业微生物学实验技术[M].天津科学技术出版社,1992.